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高速冷冻离心机在分离细胞核基质中的应用

点击次数:276  发布时间:2019-08-01
核基质是指真核细胞间核中除核被膜、染色体和核仁以外的一个精密网架系统,既包含蛋白质,又包含RNA。核基质是从纯化的细胞核中分离的。要用去污剂、核酸酸处理细胞核。以分离核基质的每一步中抑制核酸酶的活性非常重要。

本文介绍1986年Comerford使用过的分离细胞核基质的方法和步骤。

1. 大鼠肝脏(50~100g)剪碎,加3倍体积的10mmol/L Tris-HCl、2mmol/L MgCl2、250mmol/L蔗糖、1mmol/L EDTA、1mmol/L PMSF(PH=7.4,4℃)。匀浆后通过几层纱布过滤,在4℃,匀浆液以800gmax(用的是MSE Chilspin离心机,4*100ml转子,2100r/min)离心10分钟。把沉淀重新悬浮在匀浆缓冲液里,该缓冲液包含56%(质量浓度)蔗糖,再在4℃以60000gmax(用Sorvall OTD50超速离心机,A641转子,28000r/min)离心90分钟。把沉淀用20mL匀浆缓冲液洗两次。

2. 把细胞核沉淀重新悬浮在20mL STEM缓冲液中[STEM:50mmol/L Tris-HCl,50mmol/L MgCl2、250mmol/L蔗糖、1mmol/L EGTA、1mmol/L PMSF(PH=7.4,4℃)],加入四硫酸钠,终浓度为0.2mmol/L。在4℃孵育后,加入N-乙酰马来酰亚胺(N-ethylmaleimide,NEM),终浓度为5mmol/L。

3. 在800 gmax离心沉淀细胞核,并用20mL STEM洗三次,把细胞核重新悬浮在20ml STEM中,补加20μg/mL DNase I(Boehringer, grade I),在37℃孵育20分钟,再在800 gmax离心回收沉淀。

4. 把沉淀悬浮在20mL LS缓冲液里[LS缓冲液:10mmol/L Tris-HCl,0.2mmol/L MgCl2、1mmol/L EGTA、10mmol/L PMSF(PH=7.4,4℃)] ,在4℃孵育10分钟, 再在800 gmax离心10分钟回收沉淀。

5. 把沉淀重新悬浮在1mL 含有70%(质量浓度)蔗糖的LS缓冲液里。上面铺放3层蔗糖梯度,各2ml 60%,50%和40%(质量浓度)蔗糖(用含2mol/L NaCl的LS缓冲液配制蔗糖溶液)。在800 gmax离心1小时,细胞核基质在40%和50%蔗糖分离界面。回收后用STEM缓冲液(10ml)洗一次。

该方法可用于各种类型细胞核基质的分离。  
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