高速冷冻离心机在分离细胞核基质中的应用
点击次数：1196 更新时间：2019-08-01
核基质是指真核细胞间核中除核被膜、染色体和核仁以外的一个精密网架系统，既包含蛋白质，又包含RNA。核基质是从纯化的细胞核中分离的。要用去污剂、核酸酸处理细胞核。以分离核基质的每一步中抑制核酸酶的活性非常重要。
本文介绍1986年Comerford使用过的分离细胞核基质的方法和步骤。
1. 大鼠肝脏(50~100g)剪碎，加3倍体积的10mmol/L Tris-HCl、2mmol/L MgCl2、250mmol/L蔗糖、1mmol/L EDTA、1mmol/L PMSF(PH=7.4，4℃)。匀浆后通过几层纱布过滤，在4℃，匀浆液以800gmax(用的是MSE Chilspin离心机，4*100ml转子，2100r/min)离心10分钟。把沉淀重新悬浮在匀浆缓冲液里，该缓冲液包含56%(质量浓度)蔗糖，再在4℃以60000gmax(用Sorvall OTD50超速离心机，A641转子，28000r/min)离心90分钟。把沉淀用20mL匀浆缓冲液洗两次。
2. 把细胞核沉淀重新悬浮在20mL STEM缓冲液中[STEM：50mmol/L Tris-HCl，50mmol/L MgCl2、250mmol/L蔗糖、1mmol/L EGTA、1mmol/L PMSF(PH=7.4，4℃)]，加入四硫酸钠，终浓度为0.2mmol/L。在4℃孵育后，加入N-乙酰马来酰亚胺(N-ethylmaleimide，NEM)，终浓度为5mmol/L。
3. 在800 gmax离心沉淀细胞核，并用20mL STEM洗三次，把细胞核重新悬浮在20ml STEM中，补加20μg/mL DNase I(Boehringer, grade I)，在37℃孵育20分钟，再在800 gmax离心回收沉淀。
4. 把沉淀悬浮在20mL LS缓冲液里[LS缓冲液：10mmol/L Tris-HCl，0.2mmol/L MgCl2、1mmol/L EGTA、10mmol/L PMSF(PH=7.4，4℃)] ,在4℃孵育10分钟, 再在800 gmax离心10分钟回收沉淀。
5. 把沉淀重新悬浮在1mL 含有70%(质量浓度)蔗糖的LS缓冲液里。上面铺放3层蔗糖梯度，各2ml 60%，50%和40%(质量浓度)蔗糖(用含2mol/L NaCl的LS缓冲液配制蔗糖溶液)。在800 gmax离心1小时，细胞核基质在40%和50%蔗糖分离界面。回收后用STEM缓冲液(10ml)洗一次。
该方法可用于各种类型细胞核基质的分离。
本文介绍1986年Comerford使用过的分离细胞核基质的方法和步骤。
1. 大鼠肝脏(50~100g)剪碎，加3倍体积的10mmol/L Tris-HCl、2mmol/L MgCl2、250mmol/L蔗糖、1mmol/L EDTA、1mmol/L PMSF(PH=7.4，4℃)。匀浆后通过几层纱布过滤，在4℃，匀浆液以800gmax(用的是MSE Chilspin离心机，4*100ml转子，2100r/min)离心10分钟。把沉淀重新悬浮在匀浆缓冲液里，该缓冲液包含56%(质量浓度)蔗糖，再在4℃以60000gmax(用Sorvall OTD50超速离心机，A641转子，28000r/min)离心90分钟。把沉淀用20mL匀浆缓冲液洗两次。
2. 把细胞核沉淀重新悬浮在20mL STEM缓冲液中[STEM：50mmol/L Tris-HCl，50mmol/L MgCl2、250mmol/L蔗糖、1mmol/L EGTA、1mmol/L PMSF(PH=7.4，4℃)]，加入四硫酸钠，终浓度为0.2mmol/L。在4℃孵育后，加入N-乙酰马来酰亚胺(N-ethylmaleimide，NEM)，终浓度为5mmol/L。
3. 在800 gmax离心沉淀细胞核，并用20mL STEM洗三次，把细胞核重新悬浮在20ml STEM中，补加20μg/mL DNase I(Boehringer, grade I)，在37℃孵育20分钟，再在800 gmax离心回收沉淀。
4. 把沉淀悬浮在20mL LS缓冲液里[LS缓冲液：10mmol/L Tris-HCl，0.2mmol/L MgCl2、1mmol/L EGTA、10mmol/L PMSF(PH=7.4，4℃)] ,在4℃孵育10分钟, 再在800 gmax离心10分钟回收沉淀。
5. 把沉淀重新悬浮在1mL 含有70%(质量浓度)蔗糖的LS缓冲液里。上面铺放3层蔗糖梯度，各2ml 60%，50%和40%(质量浓度)蔗糖(用含2mol/L NaCl的LS缓冲液配制蔗糖溶液)。在800 gmax离心1小时，细胞核基质在40%和50%蔗糖分离界面。回收后用STEM缓冲液(10ml)洗一次。
该方法可用于各种类型细胞核基质的分离。
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